Co bych měl(a) znát, než začnu měřit 

Úvod 
    Jedním ze způsobů diagnostiky a léčení rakoviny je fotodynamická terapie [1]. Využívá vlastností některých fotosenzitizátorů především porfyrinů, schopných absorbovat záření laseru a získanou energii využít k ničení rakovinných buněk. Proces bývá zároveň doprovázen intenzivní emisí záření (zpravidla v červené oblasti spektra), na jejímž základě lze odlišit rakovinné buňky, ve kterých dochází k akumulaci fotosenzitizátoru, od buněk zdravých a tak zároveň metodu použít pro diagnostiku zhoubných nádorů. 

Mechanismus interakce fotosenzitizeru s terčem  
    Absorpce fotonu fotosenzitizátorem vede ke vzniku excitovaného singletního stavu ¹F^* (doba života jednotky až desítky ns). Následuje vnitřní přenos energie (intersystem crossing) za vzniku relativně dlouhožijícího tripletního stavu ³F (doba života stovky ms až ms). Zjednodušené schema znázorněno je na Jablonskiho diagramu

 
Jablonskiho diagram

Existují dva typy mechanismu interakce tripletního stavu fotosenzitizátoru ³F s živou hmotou:

 -mechanismus I. typu, kdy molekula předává svoji energii přímo biologickému substrátu, což vede k přímé destrukci vhodných terčů v buňkách : 

³F + terč ------- > produkty rozkladu (radikály ...)               (1) 

-mechanismus II. typu, kdy interakcí tripletního stavu s kyslíkem v základním stavu vzniká reaktivní singletní kyslík využitelný k oxidaci biologického substrátu: 

³O₂ + ³F --------> ¹O₂ + ¹F (tvorba singletního kyslíku)       (2) 

¹O₂ + terč --------------> produkty oxidace                               (3) 

Nezbytným předpokladem pro pochopení procesu fotodynamické terapie nádorů a výběr vhodného senzitizátoru je důležité znát jeho základní fotofyzikální a fotochemické parametry v daném prostředí (emisní spektra, doba života a kvantové výtěžky tripletních stavů a rychlostní konstanta jejich zhášení kyslíkem (rovnice (2), dobu života a kvantové výtěžky singletního kyslíku). 


Definice doby života a rychlostní konstanty zhášení tripletních stavů 

Koncentrace tripletových stavů fotosenzitizátoru v čase t  c_t je dána rovnicí (4). 

c_t=c₀×exp (-kt)           (4) 

kde c₀ je počáteční koncentrace tripletních stavů fotosenzitizátoru a rychlostní konstanta k je dána vztahem (5). 

k = k_et [³O₂] + k_p      (5) 

kde k_et je rychlostní konstanta zhášení tripletního stavu kyslíkem (rovnice (2)), k_p rychlostní konstanta spontánní deaktivace (v nepřítomnosti kyslíku), která zahrnuje především výměnu energie mezi tripletním stavem fotosenzitizátoru a okolním prostředím (např. rovnice (1)) a vyzáření fotonu za vzniku singletního stavu. Střední doba života tripletního stavu fotosenzitizátoru je definována jako t =1/k_p. Rychlostní konstantu ket je možno spočítat jako směrnici závislosti celkové rychlostní konstanty k pro úbytek koncetrace tripletních stavů fotosenzitizátoru na koncentraci kyslíku [³O₂] (rovnice (5)).

Koncentrace kyslíku rozpuštěného ve vodě [³O₂] lze nalézt v tabulkách: 
[³O₂] = 1.4×10^-3 mol.l^-1 v roztoku nasyceném kyslíkem 
[³O₂] = 2.8×10^-4 mol.l^-1 v roztoku nasyceném vzduchem 
[³O₂] = 0 mol.l^-1 v roztoku nasyceném inertním plynem 

Kvantové výtěžky tripletních stavů nebo singletního kyslíku resp. emise jsou definovány jako počet vznikajicích částic resp. počet emitovaných fotonů na 1 absorbovaný foton. Jejich výpočty jsou obtížnější a zpravidla vyžadují velice přesné měření energie. 
      Nejčastěji se jako fotosenzitizery v medicíně používaji deriváty hematoporfyrinu, v českém zdravotnictví se začal používat meso-tetra(4-sulfofenyl)porfyrin (TPPS₄), perspektivně se též uvažuje o sulfonovaných ftalocyaninech zinečnatém a chlorohlinitém (AlSPC). 

Struktura TPPS₄

Spektroskopická detekce singletních a tripletních stavů fotosensitizátorů  

Excitované singletní stavy  
      Kromě tvorby tripletových stavů mohou excitované singletní stavy emitovat fotony o vlnové délce závisející na struktuře fotosenzitizátoru (vlnová délka fluorescence leží v červené oblasti spektra). Množství emitovaných fotonů je úměrné koncentraci senzitizátoru v roztoku. Tato detekční metoda se nazývá laserem indukovaná fluorescence a ve speciálních případech umožňuje detekovat až jednotlivé molekuly. 

Tripletní stavy  
      Zvýšení absorbance roztoku při interakcí roztoku fotosenzitizátoru s laserovým zářením je způsobena vznikem tripletních stavů, která absorbují záření UV lampy( vlnová délka T-T na obr. 1, T-T přechody). Vzhledem k tomu, že se jedná o nestabilní částice je i změna absorbance roztoku na vhodně zvolené vlnové délce (absorpční maximum nestabilní částice) závislá na čase. Pokud je záření UV lampy na zvolené vlnové délce silně absorbováno fotosenzitizátorem v základním stavu může dojít účinkem laserového záření ke snížení absorbance roztoku. Intenzivním vybuzením částic laserovým zářením do excitovaných singletních a tripletních stavů se sníží obsazení základní energetické hladiny, které se projeví zmenšením absorpce na excitační vlnové délce Tento jev se nazývá "bleaching". 

Singletní kyslík  
      Singletní kyslík je možno přímo monitorovat na základě jeho fosforescence na vlnové délce 1270 nm. Tento signál je však velmi slabý (kvantové výtěžky fosforescence jsou nižší než 10^-4). Doba života singletního kyslíku v H₂O je asi 2-4   ms a signál bývá překryt intenzivní červenou emisí ze singletních stavů fotosenzitizátoru. Proto se často používá jako rozpouštědla D₂O, kde je doba života singletního kyslíku více 10 krát delší. 

Experimentální vybavení  
      K dispozici je zásobní roztok TPPS₄, technické plyny (kyslík, dusík, helium), pro měření časově rozvinutých spekter laserový kinetický spektrometr řízený počítačem a čerpaný barvivovým laserem. 

                                    Laserový kinetický spektrometr  

     Účinkem laserového záření v roztoku vznikají excitované částice TPPS_4. Záření emitované vzorkem je monochromatizováno a detekováno fotonásobičem. Signál (časová změna počtu dopadajících fotonů na fotonásobič při dané vlnové délce) je snímán oscilopem. Měření se provede pro sekvenci různých vlnových délek a zpracuje se na počítači ve formě závislosti fluorescence (celkového počtu fotonů, které dopadnou na fotonásobič) na vlnové délce. 
      Princip měření absorpčních spekter je obdobný jako v předchozím případě, měříme pouze změnu počtu fotonů emitovaných Xe výbojkou o dané vlnové délce a dopadající na fotonásobič po průchodu vzorkem. Pro výpočet spekter v čase t po laserovém pulsu je třeba naměřit 10-100 časových závislostí absorbance při různých vlnových délkách. Pak vyneseme závislost změny absorbance v roztoku v příslušném čase na vlnové délce. Pro absolutní měření změn absorbance je nutno znát tyto body: 
 

0 % transmitance - tzv. temný proud fotonásobiče, odezva fotonásobiče v případě, kdy na něho nedopadají žádné fotony 
100 % transmitance - odezva fotonásobiče pouze na fotony z xenonové výbojky, je zamezen vstup laserového záření do kyvety 
Pro měření singletního kyslíku se použije místo monochromátoru interferenční filtr se středem na 1270 nm a místo detektoru dioda Judson J16. 

Excitační zdroj 
      Barvivový laser FL 3002 (Lambda Physics) čerpaný excimerovým laserem. Doba pulsu cca 30 ns, energie v pulsu do 10 mJ, vlnová délka 413.5 nm 

Programové vybavení  
     Program pro řízení počítače a výpočet časově rozvinutých spekter Řídicí počítač pracuje v operačním systému RISC. Změřená data je možno si k dalšímu zpracování odnést na vlastní disketě ve formě ASCII souborů, které jsou vhodné pro další zpracování na běžném PC.

Doporučená literatura

Fotofyzikální a fotochemické procesy probíhající při fotodynamické terapii nádorů
[1] Bonnett R.: Chem.Soc.Rev. 24, 19-33(1995) .

Spektroskopické metody používané pro studium fotosenzitizerů 
[2] Bensason R.V., Land E.J., Truscott T.G. Excited States and Free Radicals in Biology and Medicine. Oxford  University Press, New York (1993).
[3] Kubát P.: Chemické Listy 90, 515-522 (1996).

Literární údaje o fotofyzikálních parametrech měřených fotosenzitizerů 
[4] Engst P., Kubát P., Jirsa M.: J. Photochem. Photobiol A 78, 215-219 (1994).
[5] Wilkinson F., Helman W.P., Ross A.B. J.Phys.Chem.Ref.Data 24, 663-1036 (1995).

Úkoly  

Úkolem je změřit některé fotofyzikální vlastnosti TPPS₄ ve vodném roztoku. 

• Připravte 5 mM roztok TPPS₄ a změřte jeho emisní spektra. K excitaci použijte barvivový laser o vlnové délce 413.5 nm (maximum absorpčního pásu TPPS₄ ležící v oblasti UV a viditelného spektra). Na jaké vlnové délce lze pomocí laserem indukované fluorescence zjišťovat přítomnost molekul TPPS₄ v roztoku. 

• Změřte změnu absorbance roztoku TPPS₄ v časech 100, 500, 1000 a 2000 ns po laserovém pulsu v oblasti 300 - 550 nm. 

• Nalezené absorpční spektra interpretujte - přiřaďte jednotlivé pásy T-T přechodům v molekule TPPS₄ ? Vysvětlete, proč v jedné části spektra dochází k poklesu absorbance roztoku po laserovém pulsu. K vysvětlení použijte UV/VIS spektra porfyrinů .

UV/Vis spektra porfyrinů

• Vypočtěte rychlostní konstantu deaktivace a střední dobu života tripletních stavů. 

• Z roztoku odstraňte kyslík, změřte časové závislosti absorbance v maximech. Vypočtěte rychlostní konstantu deaktivace tripletního stavu  a střední dobu života tripletních stavů t

• Roztok nasyťte kyslíkem, změřte časové závislosti absorbance v maximech. Vypočtěte bimolekulární konstantu pro zhášení tripletních stavů kyslíkem k_et ze závislosti rychlostní konstanty deaktivace tripletních stavů na  koncentraci kyslíku . 

• Naměřené hodnoty porovnejte s literárními údaji ( t = 200-400 ms, a k_et >10⁹ l.mol s^-1) (literatura [4]). Vysvětlete případné rozdíly.

• Připravte 5 mM roztok TPPS₄ v D₂O a změřte časovou závislost koncentrace singletního kyslíku na čase na základě jeho luminiscence na 1270 nm.  

• Vypočtěte dobu života singletního kyslíku a porovnejte ji s literárními údaji (literatura [5]). 

• Roztok zbavte kyslíku a proveďte opět detekci singletního kyslíku. Naměřený signál interpretujte. 

• Rozhodněte, zda a proč je TPPS₄ z fotofyzikálního hlediska vhodný pro diagnostiku a fotodynamickou terapii nádorů. 

Zeleně značené úkoly jsou volitelné. 
Po domluvě je možno provést měření i s jiným fotosenzitizerem.   

Připomínky? Komentáře? Dotazy? Chci poslat protokol!    Do této obálky, prosím